Увеличение содержания мочевины в крови наблюдается при:
· усиленном её образовании в результате богатого белками рациона питания, чрезмерного катаболизма белка, лейкозов, желтухи, тяжелых инфекционных заболеваний, непроходимости кишечника, ожогов, дизентерии, шока;
· уменьшении выведения с мочой при ретенционной почечной азотемии, ретенционной внепочечной азотемии (острой почечной недостаточности, опухолях мочевыводящих путей, предстательной железы, почечно-каменной болезни, недостаточности деятельности сердца);
· кровотечении из верхних отделов желудочно-кишечного тракта;
· приеме некоторых лекарств - сульфаниламидов, левомецитина, тетрациклина и других.
Снижение содержания мочевины в крови наблюдается при:
· особенно тяжелых поражениях печени, в частности при отравлении фосфором, мышьяком, декомпенсированном циррозе;
· голодании;
· пониженном катаболизме белков;
· после введения глюкозы;
· после гемодиализа.
Увеличение экскреции мочевины с мочой наблюдается при:
· злокачественной анемии (вследствие отрицательного азотистого баланса);
· лихорадке;
· после приема лекарственных препаратов (салицилатов, хинина и др.);
· гиперпротеиновой диете;
· гиперфункции щитовидной железы;
· в послеоперационный период.
Уменьшение экскреции мочевины с мочой наблюдается при:
· нефрите, уремии;
· нарушении функции почек;
· нефропатии беременных;
· паренхиматозной желтухе (вследствие нарушения образования мочевины);
· острой дистрофии печени;
· прогрессирующем циррозе печени;
· приеме анаболитических гормонов (положительный азотистый баланс).
Ответьте на вопросы:
1. Дайте определение понятиям азотистый баланс, остаточный азот, резидуальный азот, азотемии.
2. Назовите причины и виды азотемии.
3. Почему при поражениях ССС концентрация мочевины в крови увеличивается? К какому виду азотемии относиться это изменение?
4. Для диагностике каких заболеваний чаще всего исследуют уровень мочевины в крови и моче?
5. Что такое выделительная способность почек?
6. Как уровень мочевины может служить диагностике нарушений выделительной способности почек?
Практическая работа
«Определение креатинина в сыворотке крови методом Яффе».
Цели практической работы:
· закрепить знания об остаточном азоте крови, азотемии;
· научиться исследовать содержание креатинина в сыворотке крови.
Задания для самостоятельной работы:
1. Перепишите в тетрадь принцип и методику проведения практической работы.
2. Оборудуйте рабочее место для практической работы.
3. Выполните практическую работу.
4. Сделайте необходимые расчеты.
6. Сделайте вывод по работе и рисунки.
7. Ответьте на дополнительные вопросы.
Принцип:
В щелочной среде креатинин образует с пикриновой кислотой комплексное соединение желто-красного цвета (реакция Яффе). Интенсивность окраски пропорциональна концентрации креатинина в исследуемой пробе.
Ход определения:
· Проведите депротеинизацию (в центрифужной пробирке).
· Смесь тщательно перемешать и центрифугировать при 1500 об/мин в течении 15 минут.
· Центрифугат анализировать по реакции Яффе согласно таблице.
· Смеси тщательно перемешать, выдержать при комнатной температуре в течение 20 минут.
· Измерить оптическую плотность опытной пробы (Е1 ) и калибровочной пробы (Е2 ) относительно контрольной пробы при длине волны 520 нм (500-560 нм) в кювете с длиной оптического пути 5 см.
Расчет количества креатинина проводят по формуле:
С= Е1 / Е2 * 353,6 мкмоль/л
С= Е1 / Е2 * 40 мг/л.
Норма:
В сыворотке крови: у мужчин 44-100 мкмоль/л,
у женщин 44-88 мкмоль/л.
В суточной моче: 4,4-17,7 ммоль.
Примечания:
1. При использовании в качестве образца мочи, её предварительно разводят 1:100, а результат умножают на 100.
2. При необходимости количества исследуемого материала и реагентов могут быть пропорционально изменены.
3. К каждой серии анализов калибровочную пробу ставить обязательно.
Реактивы . Цветной реактив*; мочевина, стандартный раствор 1 г/л, или 16,65 ммоль/л; набор «Уреатест».
Оборудование . Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 0,1, 2 и 5 мл; алюминиевая фольга; водяная баня; ФЭК.
Материал .
Сыворотка крови.
Моча, собранная за сутки, профильтрованная и разведенная перед анализом водой в 25 раз.
а. Определение содержания мочевины в сыворотке крови. Метод основан на способности мочевины в присутствии тиосемикарбазида и солей железа в сильнокислой среде образовывать с диацетилмонооксимом соединение красного цвета, интенсивность окраски которого пропорциональна содержанию мочевины в исследуемой жидкости.
Ход определения . В опытную пробирку отмеривают 0,1 мл разведенной в 10 раз сыворотки крови, в стандартную – такой же объем стандартного раствора мочевины и в контрольную – 0,1 мл дистиллированной воды. Добавляют во все пробирки по 2 мл цветного реактива и тщательно перемешивают их содержимое встряхиванием.
Все пробирки закрывают крышечкой из алюминиевой фольги и нагревают в кипящей водяной бане в течение 10 мин (точно! ). Затем охлаждают их под струей холодной воды.
Измеряют экстинкцию стандартной и опытной проб против контрольной на ФЭКе при 540-560 нм (светофильтр зеленый) в кювете с толщиной слоя 0,5 см.
Примечание . Окраска неустойчива, поэтому измерение необходимо провести в течение 15 мин.
Расчет . Содержание мочевины х (ммоль/л) в сыворотке крови рассчитывают по формуле
Е оп 16,65∙10
где Е оп – экстинкция опытной пробы против контрольной;
Е ст – экстинкция стандартной пробы против контрольной;
16,65 – концентрация мочевины в стандартной пробе, ммоль;
Азот мочевины (в ммоль/л) рассчитывают, разделив полученное значение содержания мочевины в сыворотке на 2,14 (число, выражающее отношение молекулярной массы азота мочевины к массе всей молекулы мочевины).
б. Определение содержания мочевины в моче. Принцип метода тот же, что и в предыдущей работе.
Ход определения . Для анализа используют 0,1 мл разведенной мочи и 0,1 мл стандартного раствора мочевины и обрабатывают эти пробы так же, как и сыворотку крови.
Расчет проводят по формуле
Е оп V25∙1,665
Е ст 0,1∙1000
где х – количество мочевины, ммоль/сут;
V – объем суточной мочи;
Е оп – экстинкция опыта;
Е ст – экстинкция стандарта;
0,1 – объем мочи, взятый на исследование, мл;
1000 – коэффициент пересчета мкмоль в ммоль.
в. Определение содержания мочевины в сыворотке крови экспресс-методом с помощью набора «Уреатест». Метод основан на способности уреазы разлагать мочевину с образованием аммиака, который окрашивает полоску реактивной хроматографической бумаги в голубой цвет. Высота окрашенной зоны пропорциональна концентрации мочевины, которую рассчитывают по калибровочному графику.
Ход определения . Сыворотку крови разводят водой в отношении 1:1. На пропитанный ферментом конец бумажной полоски в 3 мм от красной парафиновой полосы наносят специальной пипеткой 0,03 мл разведенной сыворотки крови. Полоску тотчас помещают в чистую сухую пробирку, герметически закрывают ее пробкой и ставят в термостат при 37˚С. Через 20 минут полоску извлекают, измеряют высоту окрашенной в голубой цвет зоны.
Расчет . По калибровочному графику, входящему в набор «Уреатест», находят концентрацию мочевины в сыворотке крови.
Оформление работы . Сделать расчет содержания мочевины и азота мочевины в исследуемой сыворотке и моче. В выводе отметить возможные изменения в азотном обмене.
Практическое значение работы . В норме содержание мочевины в сыворотке крови человека составляет 3,0-7,0 ммоль/л, а азота мочевины – 1,2-3,7 ммоль/л. Содержание мочевины в сыворотке крови значительно колеблется в зависимости от приема белков с пищей. Повышение уровня мочевины в крови (азотемия) отмечается при заболеваниях почек (когда нарушена их выделительная функция), при усиленном распаде белков, избыточном белковом питании, а также в случае обезвоживания организма (в данном случае имеет место относительная, а не абсолютная форма азотемии). Снижение уровня мочевины в крови и выделения ее с мочой (в сутки в норме выделяется 333-582,8 ммоль/сут) наблюдается при заболевании печени (паренхиматозная желтуха, дистрофия печени, цирроз), что связано с нарушением мочевинообразовательной функции.
Работа 60. Определение концентрации мочевины в сыворотке крови и моче
С мочой у взрослого человека выделяется за сутки 20-35 г, или 333-583 ммоль мочевины. Мочевина – диамид угольной кислоты, образующийся в печени при обезвреживании аммиака. В норме в сыворотке крови содержится 3,33-8,32 ммоль/л мочевины.
Принцип метода . Мочевина образует с диацетилмонооксимом в присутствии тиосемикарбазида и солей железа в кислой среде окрашенные соединения. Интенсивность окраски прямо пропорциональна концентрации мочевины в исследуемой моче и сыворотке крови и определяется фотометрически.
Исследуемый материал : сыворотка крови, моча.
Реактивы: стандартный раствор мочевины (16,7 ммоль/л). 5%-ный раствор хлорного железа (основной раствор: 5 г хлорного железа доводят до 100 мл водой, после чего подкисляют 1 мл концентрированной H 2 SO 4 ; рабочий раствор готовят из основного: 1 мл основного раствора доводят до объема 100 мл дистиллированной водой, добавляют 8 мл концентрированной H 2 SO 4 и 1 мл 85%-ной ортофосфорной кислоты; раствор хранят в темной посуде). 2,5%-ный водный раствор диацетилмооксима, 0,25%-ный раствор тиосемикарбазида (хранят в темной посуде). Цветной реактив хлорида (готовят каждый раз перед употреблением): к 30 мл рабочего раствора хлорного железа добавляют 20 мл дистиллированной воды, 1 мл 2,5%-ного диацетилмооксима и 0,25 мл 0,25%-ного тиасемикарбазида).
Оборудование : пипетки, пробирки, ФЭК, кюветы с длиной оптического
пути 5 мм.
ХОД РАБОТЫ . Мочу перед определением развести в 10 раз. В одну пробирку вносят 0,1 мл мочи, в другую – 0,1 мл сыворотки крови, в третью – стандартный раствор мочевины. Затем во все 3 пробирки добавляют по 2 мл рабочего раствора для определения мочевины, перемешивают и ставят на кипящую водяную баню на 10 мин. Затем пробирки охлаждают в струе холодной воды и колориметрируют на зеленом светофильтре в кювете с длиной оптического пути 5 мм против воды.
Расчет производят по формуле:
167Е оп /Е ст (для мочи).
Пониженное содержание мочевины в моче отмечается при нефрите, ацидозе, паренхиматозной желтухе, циррозе печени, уремии, повышенное – при недостатке белка в питании, злокачественной анемии, лихорадке, интенсивном распаде белков в организме, после приемов салицилатов, при отравлении фосфором.
Уреазный метод определения мочевины
Мочевинаявляется основной фракцией остаточного азота, определение которой используется в диагностических целях. Синтез ее происходит в печени из аммиака, который образуется при дезаминировании аминоктислот, распада пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов.
Отклонения от нормального содержания мочевины в сыворотке крови зависит от скорости процессов синтеза мочевины и ее выделения. Увеличение содержания мочевины в сыворотке крови является одним из главных признаков нарушения почек. Из фракций остаточного азота раньше всего повышается уровень мочевины. При почечной недостаточности азот мочевины может составлять до 90% фракций остаточного азота.
Повышение уровня мочевины сыворотки крови может носить и внепеченочный характер: при потере жидкости, при усиленном распаде белков (острая атрофия печени, тяжелые печени) из-за нарушения синтеза мочевины в печени.
Принцип метода: Мочевина под действием уреазы разлагается с образованием аммиака и углекислого газа. Для уреазы мочевина является единственным субстратом, поэтому уреазные методы высокоспецифичны. Выделившийся аммиак образует с гипохлоритом натрия и фенолом окрашенный продукт – индофенол (синего цвета). Интенсивность окраски пропорциональна содержанию мочевины.
Реактивы:
2. Этилендиамин-N (N-тетрауксусной кислоты динатриевая соль).
3 ЭДТА – буфер рН 6,5: 0,6 г трилона В растворяют в 30-40 мл воды, доводят до рН 6,5 раствором едкого натра и доливают водой до 50 мл.
4. Основной раствор уреазы в буфере: 20 мг уреазы растворяют в 10 мл буфера.
5. Рабочий раствор уреазы - перед началом определения берут необходимое количество основного раствора и разводят бидистиллированной водой в отношении 1:4.
7. Натрия нитропруссид 2-водный.
8. Цветной реактив: фенол – 0,11 моль/л, нитропруссид натрия – 0,18 моль/л: 0,0263 г нитропруссида натрия помещают в мерную колбу на 500 мл, приливают примерно 300 мл воды, растворяют при перемешивании. Затем добавляют 5,18 г фенола и доливают водой до метки.
9. Натр едкий 1 моль/л; 0,26 моль/л.
10. Гипохлорид натрия:10 г хлорной извести размешивают в течение 15 минут с 17 мл воды, затем добавляют раствор, состоящий из 17 мл воды и 7 г карбоната натрия. Масса сначала густеет, а затем разжижается. Надосадочную жидкость сливают и фильтруют через промытый водный фильтр. Как только раствор приобретает слабо желтую окраску, добавляют 10 капель 1%-ного раствора крахмала и титруют до обесцвечивания.
11. Основной раствор гипохлорита натрия разводят водой так, чтобы концентрация хлора составляла 0,78 г/л, смешивают с равным объемом 0,26 моль/л раствором едкого натрия (100мл+100мл).
12. Мочевина.
13. Бензойная кислота, 2 г/л (кислоту растворяют при нагревании).
14. Калибровочный раствор мочевины, 0,5 ммоль/л: 15 мг мочевины растворяют в мерной колбе на 500 мл в 2 г/л растворе бензойной кислоты.
Ход определения: Перед определением сыворотку разводят 0,154 моль/л раствором хлорида натрия в отношении 1:9.
Опытная проба: 100 мкл рабочего раствор уреазы вносят в пробирку, добавляют 20 мкл разведенной сыворотки. Закрывают пробкой, перемешивают и инкубируют в течение 15 минут при 37 °С. После инкубации добавляют 300 мкл цветного реактива и 300 мкл рабочего раствора гипохлорита натрия. Перемешивают и инкубируют в течение 20-30 минут при 37 °С. Измеряют экстинкцию в кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны 500-560 нм (зеленый светофильтр) против холостой пробы.
Холостую пробу обрабатывают так же, как опытную, но вместо сыворотки берут 0,154 моль/л раствор.
Калибровочную пробу обрабатывают так же, как опытную, но вместо сыворотки берут калибровочный раствор мочевины. Измеряют при тех же условиях против холостой пробы.
Расчет ведут по формуле:
Количество мочевины, ммоль/л = -------- х 0,5 х 10
Где Е оо - экстинкция опытной пробы, Е к – экстинкция калибровочной пробьы: 0,5 - концентрация мочевины в калибровочном растворе ммоль/л, 10 – коэффициент разведения.
Нормальные величины. Сыворотка крови – 2, 5-8,3 ммоль/л, или 20-50 мг/100мл.
Количественное определение мочевины в сыворотке крови....................................................................................Стр10
Лабораторная работа №15
Количественное определение витамина С в сыворотке крови...................................................................................стр11
Лабораторная работа №16
Определение содержания витамина с в моче.................................................................................................................Стр11
Лабораторная работа №17
Коагуляционная проба Вельтмана.....................................................................................................................................стр12
Лабораторная работа №18
Определение общего гемоглобина методом щелочной денатурации..........................................................................стр12
Лабораторная работа №19
Определение билирубина методом Иедрашека..............................................................................................................стр13
Лабораторная работа №20
Определение кальция, фосфора в сыворотке крови титрометрическим методом
с применением мурексида...................................................................................................................................................стр14
Лабораторная работа №21
Качественные реакции на неорганические и органические составные части мочи...............................................стр14
Лабораторная работа №22
Определение белка слюны биуретовым методом.........................................................................................................стр15
Лабораторная работа № 1
Количественное определение активности амилазы слюны........................................................................................стр16
Лабораторная работа №2
Определение активности щелочной фосфатазы слюны...............................................................................................стр16
Лабораторная работа №3
Определение трансаминазной активности слюны......................................................................................................стр17
Лабораторная работа №4
Определение кальция в слюне титрометрическим методом с применением мурексида...................................стр18
Правила работы на кфк-2
1.Калориметр включить в сеть за 15 мин. до начала измерений. Во время прогрева кюветное отделение должно быть открыто (при этом шторка перед фотоприемниками перекрывает световой пучек).
2. Установить необходимый светофильтр. При переключении светофильтров ручка «чувствительность» должна находится в положении «1» (красный светофильтр 670- «1», зеленый светофильтр 540- «1»), а ручка «установка 100 Грубо» в крайнем левом положении (это предохраняет прибор от перегрузки и порчи).
3. В световой поток поместить кювету с контрольным раствором по отношению к которому производят измерения.
4. Во вторую ячейку кюветодержателя поместить кювету с исследуемым раствором.
5. Закрыть крышку кюветного отделения.
6. Ручка ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ и УСТАНОВКА 100 вначале ГРУБО, затем ТОЧНО установить отсчет 100 по шкале калориметра.
7. Поворотом ручки под кюветным отделением до упора, ввести в световой поток кювету с исследуемым раствором.
8. Снять отсчет по шкале Д в единицах оптической плотности.
Занятие № 30 работа № 1. Определение мочевины в сыворотке крови (диацетилмонооксимный метод)
Мочевина - продукт, образующийся в печени при обезвреживании аммиака. Мочевина - основной конечный продукт обмена белков. Примерно 50 % небелкового, остаточного азота крови приходится на долю мочевины.
ПРИНЦИП МЕТОДА: мочевина образует с диацетилмонооксимом в сильнокислой среде в присутствии тиосемикарбазида и ионов трехвалентного железа комплексное соединение красного цвета, по интенсивности окраски которого определяют ее концентрацию.
ХОД РАБОТЫ: взять три пробирки: опыт, стандарт, контроль.
Все пробирки поместить в водяную баню при температуре 100оС в течение 5 минут.
Охладить и произвести измерение экстинкции против контроля при 500-560 нм; кювета 10 мм. Измерения проводят в пределах 15 минут.
РЕЗУЛЬТАТ:
КОНЕЧНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ: рассчитывают по формуле:
Х = ----- х 16,65 = ммоль/л
где Х - концентрация мочевины, ммоль/л.
А 1 - экстинкция опытной пробы (Ехо).
А 2 - экстинкция стандартной пробы (Ех ст.).
РАСЧЁТ:
КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ.
Нормальное содержание мочевины в сыворотке крови у взрослых 2,5 - 8,32 ммоль/л; в моче 333 - 582 ммоль/сут.
Незначительное повышение концентрации мочевины в сыворотке крови наблюдается при избыточном питании белковыми продуктами, при старении.
Значительное увеличение концентрации мочевины в сыворотке крови (уремия) наблюдается при почечной недостаточности, обезвоживании (рвота, понос), шоке, усиленном распаде белков, сепсисе.
Пониженное содержание мочевины в сыворотке крови отмечается при паренхиматозном гепатите, циррозе (резкое снижение мочевинообразовательной функции печени), эклампсии, во время беременности.
Пониженное содержание мочевины в моче отмечается при нефрите, ацидозе, паренхиматозной желтухе, циррозе печени
ВЫВОД:
Дата ________________
Занятие № 31
САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ АУДИТОРНАЯ РАБОТА
ПО ТЕМЕ «ОБМЕН И ФУНКЦИИ АМИНОКИСЛОТ. ОБМЕН НУКЛЕОТИДОВ»
Задания для самостоятельной работы:
1.Составить метаболическую карту аминокислотного обмена.
На карте отметить:
2.1. Источники аминокислот в тканях.
2.2. Пути превращения аминокислот в тканях.
2.3. Регуляторные ферменты гликолиза, метаболизма гликогена, глюконеогенеза, пентозофосфатного пути.
2.4. Витаминзависимые ферменты.
Решение и обсуждение ситуационных задач.
Дата: ________________
ЗАНЯТИЕ № 33
РАБОТА № 1. КАЧЕСТВЕННОЕ И КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ БИЛИРУБИНА (ПО МЕТОДУ ЙЕНДРАШИКА)
ОБОСНОВАНИЕ ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ. При разрушении эритроцитов (у человека через 100-120 дней) в клетках ретикулоэндотелиальной системы костного мозга, селезенки, печени происходит распад гемоглобина. Конечным продуктом распада гема является непрямой билирубин, который поступает в кровь и транспортируется альбуминами в печень, где происходит его обезвреживание с образованием прямого билирубина.
В сыворотке крови имеется два вида билирубина. Основная форма - это непрямой (свободный) билирубин, который не связан с глюкуроновой кислотой и дает непрямую диазореакцию. В крови содержится незначительное количество прямого (связанного) билирубина - этот билирубин связан с глюкуронатом и дает прямую диазореакцию. Сумма обоих пигментов дает общий билирубин.
Нарушение обмена билирубина сопровождается развитием желтухи. В связи с этим раздельное количественное определение общего, прямого и непрямого билирубина в сыворотке крови имеет значение для дифференциальной диагностики различных типов желтух.
ПРИНЦИП МЕТОДА: диазореактив дает с прямым билирубином розовое окрашивание. Непрямой билирубин переводят в растворимое состояние добавлением к сыворотке кофеинового реактива, после этого общий билирубин определяется диазореакцией. Интенсивность окраски прямо пропорциональна концентрации билирубина в пробе.
ХОД РАБОТЫ: взять три пробирки: опыт 1, 2 и контроль.
|
ОТМЕРИТЬ |
КОНТРОЛЬ |
||
|
БИЛИРУБИН |
БИЛИРУБИН |
||
|
СЫВОРОТКА КРОВИ ДИАЗОРЕАКТИВ КОФЕИНОВЫЙ |
Содержимое пробирок перемешать и инкубировать
при температуре 18оС.
О ПЫТ 1 - фотометрия через 10 минут
п ротив контроля
ОПЫТ 2 - фотометрия через 20 минут
Длина волны: 530-550 нм, кювета 5 мм.
РЕЗУЛЬТАТ:
КОНЕЧНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ: находят по калибровочному графику. По разнице между количеством общего и прямого билирубина определяют уровень непрямого билирубина.
КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ.
Нормальное содержание общего билирубина в сыворотке крови 5,0 - 20,5 мкмоль/л; связанного билирубина (прямого) – 1,0 - 7,5 мкмоль/л; свободного билирубина (непрямого) – 1,7 – 17,1 мкмоль/л.
Повышенное содержание общего билирубина в сыворотке крови отмечается при желтухе новорожденных, повреждении гепатоцитов (воспалительном, токсическом), закупорке желчных протоков, гемолитической болезни.
При паренхиматозной желтухе:
В крови повышается содержание прямого и непрямого билирубина;
В моче появляется прямой билирубин и уробилиноген.
При обтурационной (механической) желтухе:
В крови повышается содержание прямого билирубина;
В моче появляется прямой билирубин (темная моча);
Уменьшается выделение стеркобилина (бесцветный кал).
При гемолитической желтухе:
В крови повышается содержание непрямого билирубина;
В моче повышается содержание стеркобилиногена;
Увеличивается выделение стеркобилина (темный кал).
ВЫВОД:
Содержание мочевины в сыворотке крови 20-40 мг% или 2,5-8,32 м моль /л.
Лабораторная работа №15
Количественное определение витамина с
В сыворотке крови
Принцип метода : количественного определения витамина С в сыворотки крови основан на его способности восстанавливать 2,6- дихлорфенолиндофенол, который в щелочной среде имеет синюю окраску, а в кислой красную.
Ход работы : К 5 мл сыворотки крови добавляют равный объем 20% сульфосалициловой кислоты для осаждения белков. Выпавший в осадок белок отфильтровывают, 6 мл фильтрата наливают в колбу для титрования (это будет соответствовать 3 мл сыворотки крови) и титруют из микробюретки 0,001 н раствором 2,6-дихлорфенолиндофенола до розового окрашивания, не исчезающего в течение 30 секунд. Подсчитывать содержание витамина С в крови по формуле:
г эквив. витамина С х А х 100
Х= _________________________________ =мг %
Г - эквив. Витамина С-граммэквивалент вит С =88
Н - нормальность р-ра 2,6-дихлорфенолиндофенола =0,001
А - количество мл 2,6-дихлофенолиндофенола, пошедшего на титрование.
В - количество мл сыворотки, взятой в опыт (3мл)
100-коэфициент для пересчета в мг%
Норма: 0,8-1,2 мг%.
Лабораторная работа №16 определение содержания витамина с в моче
Определение содержания витамина С в моче дает представление о запасах этого витамина в организме, так как наблюдается соответствие концентрации витамина С в крови и количество этого витамина, выделяемого с мочой.
Ход работы : в коническую колбочку отмеривают 10 мл мочи и 10 мл дистиллированной воды, перемешивают, подкисляют 1мл концентрированной уксусной кислоты и титруют 0,001 н раствором 2,6- дихлорфенолиндофенола до розового окрашивания.
Подсчитывают содержание витамина С по формуле:
0,088 х А х 1500
Х=________________= мг/сутки
А- количество 0,001н раствора 2,6 дихлорфенолиндофенола в мл, израсходованное на титрование
10-количество мочи, взятой для титрования
1500-ориентировочно взятое количество мочи.
Норма: 10-20 мг/сутки.
Лабораторная работа №17 коагуляционная проба вельтмана
Значение метода : Сыворотку крови можно представить как коллоидную систему, устойчивость которых зависит от содержания белковых фракций крови и соотношения между ними. Повышенной устойчивостью обладают альбумины – белки, с малыми размерами молекул, выраженным электрич. зарядом и высокой степенью гидратации. У глобулинов-большие размеры молекул сочетаются с меньшим зарядом и более низкой степенью гидратации. В связи с этими особенностями устойчивость глобулинов значительно ниже. Коллоидная устойчивость сыворотки крови уменьшается при снижении фракции альбуминов, при заболеваниях печени (гепатит, цирроз, острая желтая атрофия печени), при гемолитических состояниях. Также считают, что коагуляционная проба снижена при повышении содержания гамма-глобулинов, снижающих стабильность сыворотки. Увеличение пробы наблюдается при острых воспалительных и эксудативных процессах, когда увеличивается кол-во альфа- и бета- глобулинов, повышающих стабильность сыворотки.(эксудативная фаза ревматизма, активный процесс туберкулеза легких, злокачественных опухолей, больших потерях жидкости, острых инфекционных заболеваниях). В клинико-диагностических лабораториях широко используют методы при которых реакциями коагуляции обнаруживают изменения в составе белков сыворотки крови. Одним из таких методов является коагуляционная проба Вельтмана.
Принцип метода: Устойчивость р-ров высокомолекулярных соединений (белков) зависит от 2-х факторов: величины заряда молекул и степени их сольватации. В пробе Вельтмана для получения коагуляции белков сыворотки крови используется раствор СаСI2, который как электролит снижает заряд молекул и тепловую денатурацию, в результате которой молекулы белка приобретают гидрофобные свойства и теряют гидратную оболочку.
Ход работы : К 0,1 мл сыворотки крови прибавляют 4,9 мл дистил., воды, перемешивают и прибавляют 0,1 мл раствора СаСI2, встряхивают и нагревают на пламени до однократного
закипания. Охлаждают и на свету наблюдают за появлением коагуляции белка. Если белки не коагулировали, то добавляют еще 0,1 мл СаСI2 и вновь кипятят. Процедуру повторяют до тех
пор, пока не выпадут хлопья. Результаты оценивают, подсчитывая общее количество 0,5% раствора СаСI2 пошедшего на реакцию. В норме реакция наступает при добавлении 0,4- 0,5 мл СаСI2.
Работа №8 Определение содержания мочевины в сыворотке крови и моче по цветной реакции с диацетилмонооксимом
Принцип метода.
Мочевина образует с диацетилмонооксимом в сильнокислой среде в присутствии тиосемикарбазида и ионов трехвалентного железа красный комплекс.
Реактивы.
1. Стандартный раствор (10 мл)
мочевина 16,65 ммоль/л
2. Диацетилмонооксим (10 таблеток)
каждая таблетка содержит диацетилмонооксим 0,5 ммоль, тиосемикарбазид
0,08 ммоль, соль трехвалентного железа 2,5 мкмоль.
Состав реакционной смеси.
Диацетилмонооксим 5,0 ммоль/л
Тиосемикарбазид 0,9 ммоль/л
Кислота серная 0,9 моль/л
Соль железа трехвалентного 25,0 мкмоль/л
Соотношение сыворотка/ реакционная смесь 1/121
Приготовление рабочих растворов.
Раствор 1 . В мерной колбе вместимостью 50 мл растворяют в 30 мл дист. воды при повышенной температуре одну таблетку реактива 2. После охлаждения доливают водой до метки. Наличие небольшого нерастворимого осадка не мешает определению.
Устойчивость: несколько месяцев (с +15 до +25 С).
Раствор 2. Приготовляют смешиванием 1 доли Раствора 1 с 1 долей раствора серной кислоты.
Устойчивость: 1 день (с +15 до +25 С).
Проведение анализа.
Длина волны (490-540) нм
Кюветы 1 см
Температура (с +15 до +25 С)
В трех тонкостенных пробирках смешивают раствор 2 в соотношении 200 + 1 с сывороткой или разведенной мочой (проба), реактивом 1 (стандарт) или дистиллированной водой (контрольный раствор) и содержимое перемешивают. Мочу перед анализом разводят дист. водой от 1 + 50 до 1 + 100 (результат х разведение).
Расчет.
Мочевина (ммоль/л) = 16,65 х (А 1 / А 2)
Предупреждение.
Моче- 333,0 - 582,8 ммоль/сут.
Принцип метода основан на определении количества аммиака, высвобождаемющегося при разложении мочевины сыворотки или цельной крови под действием уреазы, колориметрическим методом с использование метода Несслера.
Диагностическое значение имеет повышение концентрации мочевины, которое встречается при хронических поражениях почек, усиленном распаде белков в тканях, непроходимости кишечника, закупорке мочевыводящих путей. Снижение уровня мочевины встречается при голодании, безбелковой диете, ферментных дефектах мочевинообразования.
Креатин и креатинин. Количественное определение креатинина, роль,
Диагностическое значение.
Креатин - азотсодержащая карбоновая кислота, которая встречается в организме позвоночных. Участвует в энергетическом обмене в мышечных и нервных клетках.
Креатини́н - конечный продукт креатин-фосфатной реакции. Креатинин образуется в мышцах и затем выделяется в кровь. Креатинин участвует в энергетическом обмене мышечной и других тканей. Из организма креатинин выводится почками с мочой, поэтому креатинин (его количество в крови) - важный показатель деятельности почек.
Принцип метода основан на способности креатинина реагировать в щелочной среде с пириновой кислотой с образованием окрашенных в оранжевый цвет продуктов. Интенсивность развивающегося окрашивания пропорциональна количеству креатинина.
Диагностическое значение: содержание креатинина в сыворотке крови резко возрастает при почечной недостаточности, застойной сердечной недостаточности, акромегалии, при избытке в пище белков животного происхождения.
39. Программированный контроль–3: знать формулы: ФАФС, УДФГК
(развернутые); химизм реакций обезвреживания аммиака в месте
образования, синтеза мочевины и креатинина, химизм образования
аммонийных солей, транспортных форм аммиака, обезвреживания
биогенных аминов.
ФАФС УНД УДФГК .
Механизмы обезвреживания на месте.
Синтез мочевины.
Синтези креатина .
Креатинина
:
(диацетилмонооксимный метод)
Мочевина - продукт, образующийся в печени при обезвреживании аммиака. Мочевина – основной конечный продукт обмена белков. Примерно 50% небелкового, остаточного азота крови приходится на долю мочевины.
ПРИНЦИП МЕТОДА: мочевина образует с диацетилмонооксимом в сильнокислой среде в присутствии тиосемикарбазида и ионов трехвалентного железа комплексное соединение красного цвета, по интенсивности окраски которого определяют ее концентрацию.
ХОД РАБОТЫ: взять три пробирки: опыт, стандарт, контроль.
Все пробирки поместить в водяную баню при температуре 100 о С в течение 5 минут.
Охладить и произвести измерение экстинкции против контроля при 500-560 нм; кювета 5 мм. Измерения проводят в пределах 15 минут.
РЕЗУЛЬТАТ :
С ст = 16,65 ммоль/л.
КОНЕЧНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ: рассчитывают по формуле:
С оп = ----- · 16,65 = ммоль/л.
Нормальное содержание мочевины в сыворотке крови у взрослых 2,5 - 8,33 ммоль/л; в моче 333 - 582 ммоль/сут. У новорожденных в сыворотке крови нормальное содержание мочевины составляет 3,5 – 11 ммоль/л, у детей 2-14 лет 2,5 – 8,33 ммоль/л.
Незначительное повышение концентрации мочевины в сыворотке крови наблюдается при избыточном питании белковыми продуктами, при старении.
Значительное увеличение концентрации мочевины в сыворотке крови (уремия) наблюдается при почечной недостаточности, обезвоживании (рвота, понос), шоке, усиленном распаде белков, сепсисе.
Пониженное содержание мочевины в сыворотке крови отмечается при паренхиматозном гепатите, циррозе (резкое снижение мочевинообразовательной функции печени), эклампсии, во время беременности.
Пониженное содержание мочевины в моче отмечается при нефрите, ацидозе, паренхиматозной желтухе, циррозе печени
ВЫВОД:
Дата ________________
ЗАНЯТИЕ № 31
САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ АУДИТОРНАЯ РАБОТА
ПО ТЕМЕ «ОБМЕН И ФУНКЦИИ АМИНОКИСЛОТ. ОБМЕН НУКЛЕОТИДОВ»
Задания для самостоятельной работы:
1. 1.Составить метаболическую карту аминокислотного обмена.
2. На карте отметить:
2.1. Источники аминокислот в тканях.
2.2. Пути превращения аминокислот в тканях.
2.3. Регуляторные ферменты гликолиза, метаболизма гликогена, глюконеогенеза, пентозофосфатного пути.
2.4. Витаминзависимые ферменты.
3. Решение и обсуждение ситуационных задач.
Дата: ________________
ЗАНЯТИЕ № 33
РАБОТА № 1. КАЧЕСТВЕННОЕ И КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ БИЛИРУБИНА
(ПО МЕТОДУ ЙЕНДРАШИКА)
ОБОСНОВАНИЕ ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ. При разрушении эритроцитов (у человека через 100-120 дней) в клетках ретикулоэндотелиальной системы костного мозга, селезенки, печени происходит распад гемоглобина. Конечным продуктом распада гема является непрямой билирубин, который поступает в кровь и транспортируется альбуминами в печень, где происходит его обезвреживание с образованием прямого билирубина.
В сыворотке крови имеется два вида билирубина. Основная форма - это непрямой (свободный) билирубин, который не связан с глюкуроновой кислотой и дает непрямую диазореакцию. В крови содержится незначительное количество прямого (связанного) билирубина - этот билирубин связан с глюкуронатом и дает прямую диазореакцию. Сумма обоих пигментов дает общий билирубин.
Нарушение обмена билирубина сопровождается развитием желтухи. В связи с этим раздельное количественное определение общего, прямого и непрямого билирубина в сыворотке крови имеет значение для дифференциальной диагностики различных типов желтух.
ПРИНЦИП МЕТОДА: диазореактив дает с прямым билирубином розовое окрашивание. Непрямой билирубин переводят в растворимое состояние добавлением к сыворотке кофеинового реактива, после этого общий билирубин определяется диазореакцией. Интенсивность окраски прямо пропорциональна концентрации билирубина в пробе.
ХОД РАБОТЫ: взять три пробирки: опыт 1, 2 и контроль.
Содержимое пробирок перемешать и инкубировать
при температуре 18 о С.
ОПЫТ 1 - фотометрия через 10 минут
Против контроля
ОПЫТ 2 - фотометрия через 20 минут
Длина волны: 530-550 нм, кювета 5 мм.
РЕЗУЛЬТАТ:
КОНЕЧНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ: находят по калибровочному графику. По разнице между количеством общего и прямого билирубина определяют уровень непрямого билирубина.
Прямой билирубин:
С = мкмоль/л
Общий билирубин:
С = мкмоль/л
Непрямой билирубин:
С = мкмоль/л
КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ.
Нормальное содержание общего билирубина в сыворотке крови у взрослых 5,0 - 20,5 мкмоль/л; связанного билирубина (прямого) – 1,0 - 7,5 мкмоль/л; свободного билирубина (непрямого) – 1,7 - 17,1 мкмоль/л.
У новорожденных нормальное содержание общего билирубина в сыворотке крови составляет 12 – 20 мкмоль/л, у детей 2-14 лет 8,55 – 20,52 мкмоль/л.
Повышенное содержание общего билирубина в сыворотке крови отмечается при желтухе новорожденных, повреждении гепатоцитов (воспалительном, токсическом), закупорке желчных протоков, гемолитической болезни.
При паренхиматозной желтухе:
В крови повышается содержание прямого и непрямого билирубина;
В моче появляется прямой билирубин и уробилиноген.
Уменьшается выделение стеркобилина с калом.
При обтурационной (механической) желтухе:
В крови повышается содержание прямого билирубина;
В моче появляется прямой билирубин (темная моча);
Отсутствует выделение стеркобилина (ахолический кал).
При гемолитической желтухе:
В крови повышается содержание непрямого билирубина;
В моче повышается содержание стеркобилиногена;
Увеличивается выделение стеркобилина (темный кал).
ВЫВОД:
Дата ______________
ЗАНЯТИЕ № 34
Похожая информация.
Принцип. Мочевина в кислой среде образует с диацетилмонооксимом в присутствии тиосемикарбози- да и солей железа окрашенное соединение, интенсивность окраски которого пропорциональна содержанию мочевины в сыворотке крови или моче.
Реактивы: трихлоруксусная кислота, 100 г/л;
диацетилмонооксим, 25 г/л воды. Реактив стабилен при хранении в темной посуде;
0,25%-ный раствор тиосемикарбозида (или 0,32%-ный раствор тиосемикарбозида гидрохлорида). Реактивы устойчивы при хранении в посуде из темного стекла;
серная кислота концентрированная;
85%-ная ортофосфорная кислота;
железа хлорат;
основной раствор железа хлората. 5 г хлорного железа растворяют и доводят дистиллированной водой до 100 мл, затем прибавляют 1 мл концентрированной серной кислоты;
рабочий раствор железа хлората. 1 мл основного раствора железа хлората доводят до 100 мл дистиллированной водой, добавляют 8 мл концентрированной серной кислоты и 1 мл 85%-ной орто- фосфорной кислоты. Хранят в темной посуде. Реактив годен в течение 2 нед;
цветной реактив. К 30 мл рабочего раствора железа хлората добавляют 20 мл дистиллированной воды, 1 мл 2,5%-ного раствора диацетилмонооксима и 0,25 мл 0,25%-ного раствора тиосемикарбозида. Цветной реактив готовят каждый раз перед употреблением;
калибровочный раствор мочевины - 25 мг%. 250 мг мочевины (х. ч.), высушенной в сушильном шкафу при 105 °С до постоянной массы, растворяют в мерной колбе на 1 л дистиллированной водой. В качестве растворителя можно использовать 0,2%-ный раствор бензойной кислоты (0,2 г кристаллической бензойной кислоты растворяют в 100 мл дистиллированной воды при интенсивном помешивании и нагревают на водяной бане). Стандарт, приготовленный на растворе бензойной кислоты, более стабилен, чем водный. Оба раствора при работе должны давать небольшие колебания экстинкции на ФЭКе. В ином случае требуется приготовить новый стандартный раствор.
Оборудование: фотоэлектроколориметр; водяная баня; центрифуга; центрифужные пробирки; алюминиевая фольга.
Ход определения. В центрифужную пробирку вносят
- 8 мл дистиллированной воды, 0,2 мл сыворотки крови и 1 мл 10%-ного раствора трихлоруксусной кислоты. Перемешивают и оставляют на 10-20 мин, центрифугируют 15-20 мин при 3000 мин-1. В чистую пробирку вносят 0,5 мл прозрачной надосадочной жидкости (не взмучивая осадок) и 5 мл цветного реактива. Пробирку закрывают резиновой пробкой, обернутой алюминиевой фольгой, выдерживают в кипящей водяной бане 20 мин (точно) и затем охлаждают в течение 2-3 мин под струей водопроводной воды. Измерение проводят на ФЭКе при длине волны 530-560 нм (зеленый светофильтр) против холостой пробы в кювете с толщиной слоя 1 см не позднее чем через 15 мин после охлаждения.
Расчет проводят по формуле
где х - концентрация мочевины в сыворотке крови, мг%; Еоп - экстинкция опытной пробы; Е„ - экстинкция стандартной пробы; 25 - концентрация мочевины в калибровочном растворе, мг%.
Для перевода мг% в ммоль/л полученную величину умножают на коэффициент 0,1665. Ошибка метода составляет ±4 %.
Источник’. 43.
Клиническое значение. Мочевина - основной конечный продукт азотистого обмена. Синтезируется главным образом в печени, а у жвачных животных, кроме того, в стенке рубца из азота аммиака, аминокислот и амидов. Непосредственный предшественник мочевины в печени - гуанидиновая группировка аминокислоты аргинина. На долю мочевины приходится не менее половины остаточного азота крови и 80-83 % мочи.
Мочевина главным образом выделяется почками, у жвачных животных часть ее поступает в преджелудки со слюной, где распадается до аммиака и углекислого газа с последующим использованием продуктов распада рубцовой микрофлорой. Концентрация мочевины в крови у здоровых животных колеблется от 20 до 40 мг% (3,33-6,66 ммоль/л).
Значительное повышение содержания мочевины в крови (уремия) наблюдается при циркуляторной недостаточности почек, при которой нарушается фильтрация в клубочках. Такая патология возникает при сердечной недостаточности и дегидратации. Наиболее частые причины уремии - заболевания, при которых поражаются преимущественно почечные клубочки (хронический нефрит), или задержка выделения мочи при мочекаменной болезни, аденоме предстаты и др. Уремией сопровождается почечная недостаточность.
Повышение содержания мочевины в крови наблюдали при алкалозе рубца, скармливании животным большого количества гороха, зеленых бобовых кормов (вико-овсяная смесь, горохо-овсяная смесь). Резкую уремию (до 200 мг%) наблюдают у тяжело больных диспепсией телят (И. П. Кондрахин).
Продукционная гиперазотемия возникает при механических повреждениях тканей, обширных ожогах, лихорадочных состояниях, когда идет усиленный распад тканевых белков.
Тяжесть уремии связана не с концентрацией самой мочевины (она малотоксична), а с накоплением токсических производных гуанидина - гуанидинянтарной кислоты, метилгуанидина, гауни- динуксусной и гуанидинпропионовой кислот, которые образуются в организме вследствие нарушения нормального синтеза мочевины из арганина.
Уменьшение содержания мочевины в крови бывает при длительном белковом недокорме, при нарушении мочевинообразовательной функции печени, наблюдаемой при кетозе коров.
Еще по теме Определение мочевины в сыворотке крови по цветной реакции с диацетилмонооксимом. :
- Определение железа в сыворотке крови по цветной реакции с сульфонированным (3-фенантролином.
- Определение магния в сыворотке (плазме) крови по цветной реакции с титановым желтым (по Кункелю, Пирсону, Швейгерту в модификации И. В. Петрухина).
- Определение сиаловых кислот в сыворотке крови по реакции с резорцином.
- Определение мочевой кислоты в сыворотке крови по реакции с фосфорно-вольфрамовым реактивом.
- Определение активности сорбитолдещдрогеназы (СДГ) в сыворотке крови по реакции с резорцином (метод Севела-Товарека).